Для бактериологического исследования воздуха используют. Планирование и создание безопасных продуктов. Тема. Анализ микрофлоры воздуха в помещении
Страница 87 из 91
Количественный и особенно качественный состав микрофлоры воздуха является санитарным показателем степени загрязнения воздушной среды.
Для оценки степени чистоты воздуха А. И. Шафир предложил следующие критерии. В жилых невентилируемых помещениях в летнее время воздух может считаться чистым при условии, если общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха будет меньше 1500, а зеленящего и гемолитического стрептококка меньше 16, а загрязненным, если содержит больше 2500 микроорганизмов и больше 36 стрептококков. Зимой, естественно, количество микроорганизмов в помещениях значительно увеличивается. По данным. А. И. Шафира, для чистого воздуха общее количество микробов будет меньше 4500, а стрептококков меньше 36 в 1 м3, для загрязненного - общее количество микробов больше 7000, а стрептококков больше 124.
Для определения степени чистоты воздуха применяются следующие микробиологические методы исследования.
- Метод, основанный на принципе ударного действия воздушной струи.
- Седиментационный метод.
При любом микробиологическом методе исследования воздуха учитывается как общее количество микроорганизмов в определенном объеме воздуха, так и их качественный состав. Отдельно учитывается аэробная и анаэробная микрофлора.
Для выявления аэробных сапрофитов в воздухе посев производится на мясо-пептонный агар, а при исследовании на наличие стрепто- и стафилококков воздух засевают на специальные среды (сахарный агар, кровяной агар). Для выделения и подсчета стафило- и стрептококков применяют также мясо-пептонный агар с добавлением 3% дефибринированной бараньей крови, 0,25% глюкозы и генцианвиолета 1: 50 000-1: 500 000.
Для исследования на наличие анаэробных микробов воздух засевают на железосульфитную среду (среда Вильсон-Блера). Эту среду готовят следующим образом. К 100 мл расплавленного, а затем остуженного до 80° щелочного мясо-пептонного агара добавляют 1% стерильной глюкозы, 10 мл 20% сернокислого натрия и 1 мл 8% раствора хлорного железа. Раствор хлорного железа готовится на стерильной дистиллированной воде. Раствор сернокислого натрия стерилизуется 1 час текучим паром.
Метод исследования воздуха по принципу ударной струи. Предложен ряд аппаратов для исследования воздуха методом ударной струи. Аппарат, сконструированный советским ученым Ю. А. Кротовым, имеет преимущество перед другими (рис. 124, 125).
Аппарат Кротова смонтирован в одном ящике и состоит из трех частей: 1) узла для отбора проб воздуха; 2) микроманометра; 3) питающего механизма, размещенного в деревянном футляре (электрической части).
Прибор можно подключить как на 127 V, так и на 220 V, и при помощи специального переключателя и реостата регулировать скорость проходящей через прибор струи воздуха. При помощи аппарата Кротова в течение 1 минуты можно пропустить от 25 до 50 л воздуха. Механизм действия аппарата Кротова заключается в следующем. Исследуемый воздух при помощи центробежного вентилятора, вращающегося со скоростью 4000- 5000 оборотов в минуту, энергично, засасывается через щель крышки прибора и ударяется о поверхность открытой чашки Гейденрейха, залитой питательным агаром и установленной на диске малой крыльчатки. Содержащиеся в воздухе микроорганизмы оседают на питательном агаре чашки Гейденрейха.
Рис. 124. Прибор Кротова для микробиологического исследования воздуха (общий вид).
Рис: 125. Прибор Кротова для микробиологического исследования воздуха (схема).
1 - цилиндрический корпус; 2 - основание корпуса; 3 - электромотор; 4 - центробежный вентилятор; 5 - восьмилопастная крыльчатка; 6 - диск; 7 - пружины; 8 - чашка Гейденрейха; 9 - крышки; 10 - накидные замки; 11 - диск из плексигласа; 12 - клиновидная щель; 13 - разрезное кольцо; 14 - штуцер с диафрагмой; 15 - выводная трубка.
Для равномерного распределения микроорганизмов по всей поверхности чашки столик с чашкой должен вращаться не очень быстро (60 оборотов в минуту). Из прибора воздух выводится через воздухопроводную трубку, которая соединена с микроманометром, показывающим скорость пропускания воздуха через прибор. Экспозиция чашки 10 минут, после чего мотор останавливают. Снимают крышку прибора. Достают чашку с посевом воздуха и закрывают ее крышкой. Дальше поступают так. При определении аэробной флоры чашку Гейденрейха с посевом ставят на 24 часа в термостат при температуре 37°, а затем оставляют на 24 часа при комнатной температуре и проводят подсчет всех выросших колоний на поверхности агара. Затем чашку оставляют еще на 24 часа при комнатной температуре, после чего (через 72 часа с момента посева) проводят дифференцированный подсчет, т. е. учитывают отдельно пигментные формы, спороносные формы и плесневые грибы.
Для определения количества анаэробных микроорганизмов чашку с посевом, вынутую из прибора Кротова, для создания анаэробных условий роста микробов дополнительно заливают 10-15 мл мясо-пептонного агара и ставят в термостат при температуре 37° на 24 часа.
На сульфитном агаре, которым залита чашка до посева, анаэробные микробы дадут рост в виде почерневших колоний, по числу которых можно судить о степени загрязнения воздуха анаэробными микробами.
Бактериальное загрязнение воздуха выражается общим числом микробов в 1 м3 его.
Пример. Через аппарат Кротова пропущено за 10 минут 125 л воздуха, на поверхности среды выросло 100 колоний.
Число микробов в 1 м3 воздуха 
Седиментационный метод исследования воздуха (чашечный метод). Седиментационный метод является наиболее простым методом для изучения микрофлоры воздуха, хотя не обладает большой точностью.
Если применять чашки одного диаметра при одном сроке экспозиции, то этот метод может быть использован для получения сравнительных данных по бактериальному загрязнению воздуха. Техника этого метода заключается в следующем. Чашки Гейденрейха-Петри с застывшим агаром выставляют в открытом виде на разных высотах в помещении на различные сроки (от 15 минут
до 1.5 часов). Затем чашки закрывают и ставят в термостат. Инкубацию посевов производят по методике, описанной выше.
Для пересчета количества микробов на 1 м3 пользуются формулой В. Л. Омелянского, который считал, что в течение 10-минутной экспозиции на поверхность плотной питательной среды 100 см2 оседает столько микробов, сколько их находится в 10 л воздуха. Им была составлена соответствующая таблица расчета, пользуясь которой можно высчитать общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха. В этой таблице даны постоянные множители, на которые надо умножить полученные количества колоний в зависимости от диаметра и площади чашки, где производится посев. Приводим схему постоянных множителей для расчета количества микробов по Омелянскому (табл. 34).
Таблица 34
Расчет числа микробов в 1 м3 воздуха (по Омелянскому)
Диаметр чашки в см |
Площадь чашки в см2 |
Множитель расчета числа микробов в 1 м3 воздуха |
Пример. На чашке площадью 63 см2 выросло 25 колоний. Количество микробов в 1 м3 воздуха в данном случае равно 25X80 = 2000.
ТЕМА 3. ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МИКРОБНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУХА ПОМЕЩЕНИЙ
ТЕМА 3. ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МИКРОБНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУХА ПОМЕЩЕНИЙ
Цель занятия: изучение методов определения и оценки бактери- альной загрязненности воздушной среды помещений.
При подготовке к занятию студенты должны проработать следующие вопросы теории.
1. Эпидемиологическое значение воздушной среды. Источники микробного загрязнения воздуха помещения.
2. Характеристика бактериального состава атмосферного воздуха и воздуха помещений. Факторы, способствующие снижению микробного загрязнения воздуха помещений.
3. Значение бактериального загрязнения воздуха при изготовлении лекарственных препаратов.
4. Методы исследования и оценки степени бактериального загрязнения воздуха закрытых помещений.
После освоения темы студент должен знать:
Методику проведения отбора проб воздуха, их анализа, определение степени бактериального загрязнения воздуха аптечных помещений;
Расчет необходимой мощности и количества бактерицидных облучателей при обеззараживании воздуха и поверхностей помещений аптек;
уметь:
Оценить результаты исследований воздуха на соответствие гигиеническим нормативам;
Оценить условия труда персонала аптек при воздействии биологических факторов по данным санитарно-гигиенического обследования и лабораторных исследований;
Использовать основные нормативные документы и информационные источники справочного характера для организации контроля за уровнем микробного загрязнения в воздухе аптечных помещений и разработки профилактических мероприятий по предупреждению и снижению уровня загрязнения воздуха аптечных помещений.
Учебный материал для выполнения задания
Воздух может загрязняться аэропланктоном, т.е. бактериями, вирусами, спорами плесневых грибов, дрожжевыми грибами, цистами простейших, спорами мхов и др. Основным источником загрязнения воздуха служит почва. Попадающие в атмосферный воздух микроорганизмы сравнительно быстро погибают вследствие высыхания, действия ультрафиолетовых лучей Солнца и отсутствия питательного материала. Однако в приземном слое атмосферы и в воздухе плохо вентилируемых закрытых помещений всегда обнаруживаются сапрофитные и иногда и патогенные микроорганизмы.
При производстве лекарственных препаратов на основе биологического синтеза работающие могут подвергаться воздействию аэрозоля живых клеток микробов-продуцентов, продуктов метаболизма микроорганизмов и пылевидных конечных продуктов, часто содержащих более 50% белка (например, на заводах, изготавливающих белково-витаминные концентраты). На этапах собственно получения и выделения антибиотиков, а также на заключительных этапах (сушка, фасовка, упаковка) работающие могут подвергать- ся воздействию пыли антибиотиков. Контроль за содержанием в воздухе вредных веществ биологической природы (антибиотики, ферменты, витамины и др.) проводят аналогичным способом: как это принято для химических веществ в соответствии с требованиями Методических указаний «Микробиологический мониторинг произ- водственной среды» (МУ 4.2.734-99) и Приложения 10 Руководства 2.2.755-99 «Методика контроля содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны».
В помещениях аптек бактериальное загрязнение воздуха, происходящее за счет выделений посетителей и работников аптек, имеет большое значение, так как является причиной возможного инфицирования персонала возбудителями различных инфекционных заболеваний, а также опасности попадания микроорганизмов в лекарственные средства. Попавшая в лекарственные препараты микрофлора приводит к изменению их физико-химических свойств, снижению терапевтической активности, уменьшению сроков хранения, может явиться причиной развития заболеваний и осложнений у больного. Наиболее интенсивное бактериальное загрязнение воздуха отмечается в торговом зале, моечной и вспомогательных помещениях.
Биологическими компонентами пыли помещений являются микрофлора (бактерии, вирусы и грибы) верхних дыхательных путей, кожи, микроскопические клещи, споры плесневых грибов. Санитарнопоказательными микроорганизмами в воздухе закрытых помещений являются стафилококки, зеленящие стрептококки, а показателями прямой эпидемической опасности - гемолитические стрептококки. Несмотря на сравнительно короткий срок пребывания в воздухе, микробы создают эпидемическую опасность. Источниками микробного загрязнения воздуха в стационарах всех типов являются медицинский персонал и больные, страдающие стертыми (бессимптомными) формами инфекционных болезней, а также носители полирезистентных к антибиотикам штаммов патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Нормативов содержания микроорганизмов в воздухе жилых помещений нет. Нормативы бактериальной чистоты производственных помещений (больниц, аптек) разработаны в зависимости от их функционального назначения с учетом интенсивности бактериальной обсемененности и риска возникновения внутрибольничных инфекций. В соответствии с нормативными документами (СанПиН 2.1.3.1375-03) бактериальную чистоту воздуха оценивают дифференцированно по общему количеству микроорганизмов в 1 м 3 воздуха, а в помещениях классов А, Б, и В необходимо контролировать наличие колоний Staphylococcus aureus, которые не должны определяться в 1 м 3 воздуха, и плесневых и дрожжевых грибов, которые не должны определяться в 1 дм 3 воздуха.
Одним из эффективных методов обеззараживания воздуха является использование бактерицидного действия ультрафиолетовых лучей с длиной волны 254-257 нм. В целях санации аптечных и лечебных помещений в настоящее время применяются бактерицидные увиолевые лампы БУВ-15, БУВ-30, представляющие собой газоразрядные ртутные лампы низкого давления. Лампы сделаны в виде трубок разной длины из увиолевого стекла и наполнены газовой смесью, состоящей из паров ртути и аргона. В концы трубок впаяны вольфрамовые электроды. При пропускании тока через трубку возникает газовый разряд, в результате которого происходит свечение. Увиолевое стекло лампы пропускает УФ-лучи, убивающие микробы, обеспечивая при этом высокий обеззараживающий эффект.
В аптеках применяются потолочные бактерицидные облучатели (ПБО) и настенные бактерицидные облучатели (НБО). ПБО имеют
две экранированные лампы БУВ-15 и две открытые лампы БУВ-30. При использовании ПБО, особенно при включении неэкранированных бактерицидных ламп, обеззараживающий эффект наступает за счет действия прямого потока лучей. НБО имеет две бактерицидные лампы: одна, экранированная лампа, облучает верхнюю зону и другая - неэкранированная - нижнюю зону. Надежный бактерицидный эффект достигается при работе бактерицидных облучателей в течение двух часов при мощности ламп 3 Вт на 1 м 3 .
При длительной работе бактерицидных ламп в воздухе помещений могут накапливаться озон и окись азота в количестве, превышающих ПДК этих веществ, поэтому использование ультрафиолетового облучения требует соблюдения правил техники безопасности. В присутствии работающих рекомендуется применять экранированные бактерицидные лампы мощностью 1 Вт на 1 м 3 , а в отсутствии людей используются бактерицидные лампы открытого типа (НЭ) мощностью 3 ВТ на 1 м 3 . ПБО и НБО являются стационарными бактерицидными установками. В настоящее время в лечебно-профилактических учреждениях и аптеках применяются передвижные бактерицидные облучатели, что дает возможность более эффективно производить обеззараживание воздуха.
Определение количества бактерий осуществляется седиментационным или аспирационным методами.
Седиментационный метод основан на естественном осаждении бактерий из воздуха на чашку Петри с питательной средой и последующим выдерживанием в термостате в течение двух суток при температуре 37 ?С и подсчетом колоний, выросших за это время на всей площади чашки.
Принцип аспирационного метода - аспирация определенного объема воздуха с высеванием содержащихся в нем бактерий на поверхность питательной среды с применением щелевого прибора Кротова (рис. 10) или с помощью микробиологического импактора воздуха «Флора-100».
Прибор Кротова представляет собой цилиндр со съемной крышкой, в котором находится электромотор с центробежным вентилято- ром. Принцип работы прибора основан на инерционном осаждении частиц аэрозоля на поверхность питательной среды. Исследуемый воздух всасывается со скоростью 20-25 л/мин через клиновидную
щель в крышке прибора, ударяется о поверхность плотной питательной среды, и микробы задерживаются на ее влажной поверхности. Для равномерного посева микробов чашка Петри с питательной сре- дой помещается на подставку, вращающуюся со скоростью 1 оборот в 1 с. Скорость аспирации воздуха регулируется по микроманометру (реометру) прибора. Общий объем пробы при значительном загрязнении воздуха должен составлять 40- 50 л, при незначительном - более 100 л. Продолжительность аспирации 2-5 мин. После инкубирования отобранных проб при температуре 37 ?С в течение 1-2 суток в зависимости от выделяемых микроорганизмов производится подсчет выросших колоний. Учитывая объем взятой пробы воздуха, вычисляется количество микробов в 1 м 3 воздуха.
Рис. 10. Прибор Кротова для бактериологического исследования воздуха
Импактор «Флора-100», современная модель прибора для улавливания бактерий из воздуха, работает в автоматическом режиме и превосходит прибор Кротова по техническим характеристикам.
Определение количества микроорганизмов в воздухе служит одним из гигиенических критериев его чистоты. О степени бактери- ального загрязнения воздуха судят по общему количеству бактерий, содержащихся в 1 м 3 воздуха. Кроме того, оценку воздуха можно дать по содержанию санитарно-показательных микроорганизмов (разных видов стрептококков и стафилококков) - обычных обитателей слизистых оболочек дыхательных путей человека. Содержание микроорганизмов в воздухе различно в разные сезоны года. В холод-
ный период воздух имеет меньшее микробное загрязнение, а летом воздух больше загрязняется микробами, поступающими в него в большом количестве вместе с частичками почвенной пыли. В качестве ориентировочных показателей оценки бактериального загрязнения воздуха в жилых помещениях используются предложенные А.И. Шафиром следующие величины (табл. 9).
Таблица 9. Оценка чистоты воздуха по бактериологическим показателям воздуха аптечных помещений в разные периоды года
Оценка чистоты воздуха | ||||
Летний период (апрель-сентябрь) | Зимний период (октябрь-март) |
|||
Всего микроорганизмов | Гемолитического стрептококка | Всего микроорганизмов | Гемолитического стрептококка |
|
Чистый | <3500 | <5000 | ||
Умеренно загрязненный | 3500-5000 | 24-52 | 5000-7000 | 52-124 |
Загрязненный | >5000 | >7000 | >124 |
|
Лабораторная работа «Определение и оценка микробного загрязнения воздуха»
Задания студенту
1. Произвести бактериологический посев воздуха с помощью прибора Кротова.
2. Произвести подсчет колоний в чашке Петри, посев воздуха на питательную среду которой был сделан с помощью аппарата Кротова сутки назад со скоростью 20 л/мин в течение 5 мин и которая находи- лась в термостате при температуре 37 ?С в течение суток.
3. Определить уровень бактериального загрязнения в помещении аптеки.
4. Дать гигиеническую оценку эффективности работы бактерицидных ламп по условиям ситуационной задачи.
Методика работы
Определение микробного загрязнения воздуха
Получив одну из чашек Петри с выросшими микробными колониями, ознакомиться с содержащимися в задаче сведениями о времени,
месте и условиях отбора пробы воздуха (скорость и время аспирации).
Для подсчета числа колоний надо разделить поверхность чашки на 4 равных стора, нанеся линии раздела на стекло крышки. Подсчитать общее число колоний на поверхности j чашки и умножить на 4. Подсчет можно осуществлять простым глазом или через лупу. Число выросших колоний можно принять примерно равным количеству микробных тел в посеянном на чашку Петри объеме воздуха. Затем, учитывая условия отбора пробы, рассчитать общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха помещения.
Оценку степени микробного загрязнения воздуха произвести в соответствии с градациями, приведенными в табл. 9.
Расчет необходимой мощности и количества УФ-облучателей в помещении
Необходимая мощность (N) бактерицидных ламп определяется по формуле:
N = E V,
где: E - нормируемая величина удельной мощности ламп:
3 Вт/м 3 - для ламп открытого типа,
1 Вт/м 3 - для ламп экранированного типа,
V - объем помещения, м 3 .
Необходимое количество бактерицидных ламп (К) определяется по формуле:
К = N / (мощность бактерицидной лампы).
Санитарно-микробиологическое исследование воздуха можно разделить на 4 этапа:
1) отбор проб;
2) обработка, транспортировка, хранение проб, получение концентрата микроорганизмов (если необходимо);
3) бактериологический посев, культивирование микроорганизмов;
4) идентификация выделенной культуры.
Отбор проб:
Правильное взятие проб гарантирует точность исследования. В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые 20 м 2 площади - одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка - в центре. Пробы воздуха забираются на высоте 1,6-1,8 м от пола - на уровне дыхания в жилых помещениях. Пробы необходимо отбирать днем (в период активной деятельности человека), после влажной уборки и проветривания помещения. Атмосферный воздух исследуют в жилой зоне на уровне 0,5-2 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в зеленых зонах (парки, сады и т.д.) для оценки их влияния на микрофлору воздуха.
Следует обратить внимание на то, что при отборе проб воздуха во многих случаях происходит посев его на питательную среду.
Все методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные.
Седиментационный - наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5-10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микробов применяют среду Гарро или Туржецкого (для обнаружения стрептококков), молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), суслоагар или среду Сабуро (для выявления дрожжей и грибов). При определении санитарно- показательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40-60 мин.
По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в термостат на сутки для культивирования при температуре, оптимальной для развития выделяемого микроорганизма, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.
Седиментационный метод имеет ряд недостатков: на поверхность среды оседают только грубодисперсные фракции аэрозоля; нередко колонии образуются не из единичной клетки, а из скопления микробов; на применяемых питательных средах вырастает только часть воздушной микрофлоры. К тому же этот метод совершенно непригоден при исследовании бактериальной загрязненности атмосферного воздуха.
Более совершенными методами являютсяаспирационные , основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1),бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.
Прибор Кротова. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях
Аппарат Кротова
Принцип работы аппарата Кротова (рис. 22) основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе.
Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1). Прибор основан на аспирационно-ионизационном принципе действия. БВЭП-1 состоит из осадительной камеры, в которую вмонтированы электроды: отрицательный в виде приводящей трубки, через которую поступает воздух (и частички аэрозоля соответственно заряжаются отрицательно), и положительный, на котором оседают бактерии.
Прибор МБ. Этот прибор служит не только для определения общей микробной обсемененности, но и для отбора проб воздуха с аэрозольными частицами различных размеров. Прибор МБ построен по принципу «сита» и представляет собой цилиндр, разделенный на 6 горизонтальных полос, на каждую из которых помещают чашки Петри с МПА. Воздух просасывается, начиная с верхней ступени, в пластине которой отверстия самые крупные, и чем ниже ступень, тем меньше размером отверстия (через последние проходят только тонкодисперсные фракции воздушного аэрозоля). Прибор рассчитан на улавливание частиц аэрозоля размером более 1 мкм при скорости отбора воздуха 30 л/мин. Уменьшение числа отверстий обеспечивает более равномерное распределение по питательной среде аэрозоля из воздуха. Для улавливания еще более мелких частиц аэрозоля можно добавлять дополнительно фильтр из фильтрующего материала АФА.
При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха. Во многих случаях отбор проб совмещен с этапом посева.
Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства: а) химические - обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты, б) механические - пропускание воздуха через специальные фильтры, в) физические - ультрафиолетовое облучение.
Микроорганизмы - мельчайшие, главным образом одноклеточные существа, широко распространенные в природе. Они обнаруживаются во всех средах (воздухе, почве, воде), в организме человека и животных, в растениях.
Качественное разнообразие и количество микроорганизмов зависят в первую очередь от питательных соединений. Однако немаловажное значение имеют также влажность, температурный режим, аэрация, действие солнечных лучей и прочие факторы.
Методы санитарно-микробиологического исследования природных сред позволяют выявить наличие патогенных микроорганизмов, определить их количество и, в соответствии с полученными результатами, выработать меры по устранению или предупреждению инфекционных заболеваний. Кроме того, количественный учет необходим для моделирования экосистем и разработке принципов управления естественными процессами. Рассмотрим далее, какими бывают .
Почва
Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить "микробное число" (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).
Анализ грунта: общие сведения
К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином "почвенная биота". Грунт - среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.
Микроскопический метод микробиологического исследования: этапы
Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап - подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.
Отбор образцов
При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.
На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой - порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.
Подготовка к исследованию
Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.
Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.
Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.
Подсчет клеток на фиксированных мазках
Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования , разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.
Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.
После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.
Посев на плотные среды
Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.
Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.
Анализ воды
Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.
Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.
В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.
Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр - минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.
Определение микробного числа
Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.
Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.
Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.
Воздух
Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.
Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.
В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.
Седиментация
Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.
Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.
Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.
Приказ 535 "Об унификации микробиологических методов исследования"
Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.
Диагностика вирусных инфекций
Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.
Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.
ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.
При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.
Седиментационный - наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5-10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микробов применяют среду Гарро или Туржецкого (для обнаружения стрептококков), молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), суслоагар или среду Сабуро (для выявления дрожжей и грибов). При определении санитарно- показательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40-60 мин.
По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в термостат на сутки для культивирования при температуре, оптимальной для развития выделяемого микроорганизма, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.
Седиментационный метод имеет ряд недостатков: на поверхность среды оседают только грубодисперсные фракции аэрозоля; нередко колонии образуются не из единичной клетки, а из скопления микробов; на применяемых питательных средах вырастает только часть воздушной микрофлоры. К тому же этот метод совершенно непригоден при исследовании бактериальной загрязненности атмосферного воздуха.
Более совершенными методами являютсяаспирационные , основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1),бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.
Прибор Кротова. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях
Принцип работы аппарата Кротова (рис. 22) основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 20-25 л/мин в течение 5 мин. Таким образом, определяется флора в 100-125 л воздуха. При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л.
Приемник перед забором пробы воздуха заполняется 3-5 мл улавливающей жидкости (водой, мясопептонным бульоном, изотоническим раствором хлорида натрия).
Прибор Речменского работает по принципу пульверизатора: при прохождении воздуха через узкое отверстие воронки жидкость из приемника через капилляр в виде капелек поднимается в цилиндр. Капли жидкости еще больше дробятся, ударяясь о стеклянную лопаточку и стенки сосуда, создавая облачко из мелких капелек, на которых и адсорбируются находящиеся в воздухе микроорганизмы. Насыщенные бактериями капли жидкости стекают в приемник, а затем опять диспергируются, что обеспечивает максимальное улавливание бактерий из воздуха. При работе прибор помещают под углом 15-25°, что обеспечивает стекание улавливающей жидкости в приемник. Скорость отбора проб воздуха через аппарат Речменского - 10-20 л/мин. По окончании работы жидкость из приемника забирают стерильной пипеткой и засевают (по 0,2 мл) на поверхность плотных питательных сред. Преимуществом бактериоуловителя Речменского является высокая эффективность улавливания бактериальных аэрозолей. Недостатки прибора заключаются в трудности его изготовления, нестандартности получаемых аппаратов, их большой хрупкости и сравнительно низкой производительности.
Большим преимуществом являются серийный выпуск этого прибора (что дало возможность оснастить им лаборатории), его портативность, более высокая производительность (20-25 л/мин). Колба прибора, в которую помещается улавливающая жидкость, изготовляется из термостойкого плексигласа, капилляр из нержавеющей стали. В колбу вмонтирован пульверизатор, вызывающий диспергирование улавливающей жидкости при просасывании воздуха. Такое устройство дает возможность легко очищать и стерилизовать колбу с диспергирующим устройством простым кипячением в течение 30 мин (автоклавирование недопустимо, так как оно вызывает деформацию цилиндра).
Перед забором проб воздуха в колбу вносят 5-10 мл улавливающей жидкости (чаще всего мясопептонный бульон) и устанавливают ее под углом 10°, что обеспечивает естественное стекание жидкости после диспергирования. Воздух, проходя через колбу и пульверизатор, вызывает образование мелких капелек улавливающей жидкости, на которых оседают микроорганизмы. Прибор ПОВ-1 применяется для исследования воздуха закрытых помещений на общую микробную обсемененность, для обнаружения патогенных бактерий (например, микобактерий туберкулеза) и респираторных вирусов в воздухе больничных палат.
Пробоотборник «Тайфун» Р-40 (М) бактериологический предназначен для определения общего бактериального обсеменения воздуха с последующим выделением различных патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов.
Посев микроорганизмов из окружающего воздуха осуществляется через калиброванное отверстие в смотровом отсеке на чашку Петри с питательной средой, закрепленную на вращающемся столике прибора. Прокачка воздуха осуществляется с помощью встроенного в пробоотборник «Тайфун» Р-40 (М) бактериологический роторного пневмонасоса, крепление на вращающемся столике универсальное, что позволяет использовать чашки Петри различных модификаций.
В бактериологическом пробоотборнике «Тайфун» Р- 40 (М) обеспечена герметичность внутренней камеры и легкий доступ к исследуемой среде.
Скорость вращения чашки плавно устанавливается при помощи регулятора скорости, расположенного на передней панели пробоотборника (рис.23) «Тайфун» Р-40 (М).
Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (а следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор, в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках Петри или жидкой питательной средой (15-20 мл). Прибор переносной с большой производительностью 150-250 л/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5-6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa. Staph, aureus и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.
Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1). Прибор основан на аспирационно-ионизационном принципе действия. БВЭП-1 состоит из осадительной камеры, в которую вмонтированы электроды: отрицательный в виде приводящей трубки, через которую поступает воздух (и частички аэрозоля соответственно заряжаются отрицательно), и положительный, на котором оседают бактерии.
Прибор МБ. Этот прибор служит не только для определения общей микробной обсемененности, но и для отбора проб воздуха с аэрозольными частицами различных размеров. Прибор МБ построен по принципу «сита» и представляет собой цилиндр, разделенный на 6 горизонтальных полос, на каждую из которых помещают чашки Петри с МПА. Воздух просасывается, начиная с верхней ступени, в пластине которой отверстия самые крупные, и чем ниже ступень, тем меньше размером отверстия (через последние проходят только тонкодисперсные фракции воздушного аэрозоля). Прибор рассчитан на улавливание частиц аэрозоля размером более 1 мкм при скорости отбора воздуха 30 л/мин. Уменьшение числа отверстий обеспечивает более равномерное распределение по питательной среде аэрозоля из воздуха. Для улавливания еще более мелких частиц аэрозоля можно добавлять дополнительно фильтр из фильтрующего материала АФА.
При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха. Во многих случаях отбор проб совмещен с этапом посева.
Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства: а) химические - обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты, б) механические - пропускание воздуха через специальные фильтры, в) физические - ультрафиолетовое облучение.
Загрузка...
